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病原檢測在豬場疫病防控中的作用

發布時間:2018-02-24 10:33:19

       

    豬病是制約養豬生產的重要因素之一,近年來隨著養殖規模的不斷擴大及國外引種數量的增長,我們發現養殖硬件設施和養豬人的水平在不斷提高,但是疫情越來越復雜,防控越來越難。目前豬場病原多交叉、混合感染,表現出綜合癥候群的癥狀,臨床表現以全身性感染疾病、呼吸道感染疾病和消化道感染疾病居多。毒株的變異增加了疫病的復雜性和防控難度,比如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)最大的特征就是基因變異快速而復雜,而各個毒株的感染性與致病力差異較大;病原的隱性感染和亞臨床感染導致豬群處于亞健康狀態,種豬的隱性帶毒導致了病原的廣泛傳播;已經控制的疫病再次出現疫情,近兩年,全國一些大型豬場再次爆發豬丹毒等疫病。廣大從業者逐漸意識到僅靠生產數據、臨癥、病變進行判斷是較為困惑的,而且疫情一旦發生,治療時間越長,豬場損失越大;因此當豬群出現疫情時,正確的診斷是采取進一步措施的必要前提。此時除了生產數據、臨癥、病理剖解等“外部信號”,我們還需要借助實驗室檢測結果的“內部信號”來共同確認,實驗室監測已經成為生物安全體系不可或缺的重要環節。

實驗室檢測包括疫病診斷分析(病原檢測)和血清學檢測(抗體檢測)。病原檢測是指通過實驗室手段,如PCR或RT-PCR、細菌鑒定等方式找到使豬群患病的“兇手”;病原檢測用于種豬引進、生物安全監控、豬場疫病病原監控,可以適時掌握豬場有無特定病原感染,尤其是臨床感染出現以前的發現,對維持豬場健康和降低發病風險具有重要意義;在發病時,快速而準確的分子診斷技術能夠為豬場的快速病原鑒定與解決方案提供重要依據。抗體檢測是指根據抗原抗體特異性反應來確定是何種病原產生的抗體,主要用于評估豬群免疫水平,評價豬群免疫狀況。作為輔助工具,實驗室檢測能夠提供科學、規范、直觀的檢測報告和分析意見,切實為豬場的疫病防控提供參考。那么實驗室檢測應該怎么運用到豬場疫病防控中呢?病原檢測與抗體檢測又該怎樣有效的結合呢?本文就豬場常規病毒性傳染病病原進行實驗室檢測(流行病學調查、檢測方向和目的、樣品采集和處理、檢測方法等)做一說明。

1 流行病學調查

在進行實驗室檢測之前我們需要做流行病學調查。調查包括豬群發病和死亡情況、臨床癥狀、流行的特點和規律等,具體包括飼養規模、品種、代別、飼料情況、過去發生疫病情況、引種、周邊疫情、臨癥及剖檢病變、免疫等。前期調查作為實驗室檢測的一個基礎性工作,對實驗室檢測的大方向奠定基礎。

2 檢測目的

根據不同目的制定相應的檢測方案:

引種檢疫:病原檢測與抗體檢測結合,同時檢測引種豬群帶毒情況和抗體水平;100%檢測,避免漏檢;

制定與修改免疫程序:病原檢測與抗體檢測結合,在了解豬場病原感染的基礎上,掌握豬群免疫情況,從而選擇免疫效果好的疫苗、恰當的免疫時機和病種;按照公豬100%、母豬5%、仔豬2%的比例進行檢測;

規范治療:有效治療的前提是準確的診斷,通過病原檢測準確掌握豬群感染了哪些病原,再結合臨床癥狀和病理剖檢分析,可以做到規范治療;建議根據發病群體的數量決定檢測比例,大群體10個病豬以上,小群體5個病豬以上。

3 樣本的采集及處理


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    采集樣本的時機應恰當,由于多數弱毒疫苗不帶有標記基因,病原檢測無法區分疫苗毒和野毒,因此在采樣時應避開疫苗排毒時間(詳見表1);由于不同病原的靶器官不同,因此在檢測不同病原時應選擇不同的樣本(詳見表2)。

表1 豬常規病原免疫后疫苗排毒時間

三、采樣時機

采集樣本的時機應恰當,由于多數弱毒疫苗不帶有標記基因,病原檢測無法區分疫苗毒和野毒,因此在采樣時應避開疫苗排毒時間(見表2)。

 樣本采集時應做好人身防護,采集的樣本做好標記,如品種、日齡、時間、地點等。樣本采集后若立即進行實驗,則將樣本放置于4℃下;若需要運輸則經穩定化處理后冷凍盡快送至實驗室。檢測員在接到樣本后應對樣本進行前處理,血液樣本可經過離心或靜置析出血清,組織樣本可加生理鹽水研磨后離心取上清液。

4 檢測方法

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樣本處理后,可使用相應的病原檢測試劑盒進行檢測。目前常用的病原檢測方法是基于分子生物學的核酸擴增法,根據核酸擴增中溫度變化要求可分為兩大類:一類是PCR擴增,一類是恒溫擴增。PCR擴增需要通過幾十個溫度的循環變化來實現核酸擴增,這樣的過程通常需要精密而復雜的儀器(PCR儀)來控制,擴增后的產物需要通過凝膠電泳配合凝膠成像系統才能得到檢測結果,PCR法需要配置精密、昂貴的儀器和試劑,操作復雜、耗時長,且極易受污染,導致假陽的發生;而恒溫擴增則是擴增反應的全過程在同一溫度下進行,僅需一臺恒溫水浴鍋就可完成。目前恒溫擴增技術主要包括環介導等溫擴增技術、滾環擴增技術、轉錄酶擴增技術、依賴核酸序列擴增技術等,這些技術均為國外公司擁有。交叉引物恒溫擴增技術則是由四川納比生物科技有限公司合作開發的一種新的核酸恒溫擴增技術,也是中國首個具有自主知識產權的核酸擴增技術。四川納比生物科技出品的交叉引物恒溫擴增試劑盒是以交叉引物恒溫擴增技術(CPA)為支撐,結合核酸試紙條快速檢測技術建立CPA高新分子移動診斷平臺,整個檢測過程簡單方便,無需復雜的儀器、專業的人員,檢測結果更準確可靠。

需要結合抗體檢測時,也可以使用相應的商品化抗體檢測試劑盒進行檢測。


5 小結

@NGU19KK95[POT{]0Q}[GAM.png目前養豬業豬病復雜、一個豬場多種病原感染的問題普遍存在。但我們通過大量檢測數據發現,即使某個豬場存在多種病原感染的情況下,并非任何時候任何病原都可以在任何病料樣品中都檢測出來。

豬主要病毒性疾病表現以全身性感染、呼吸道感染、消化道感染居多。比如感染藍耳病、偽狂犬等病原的豬只,在臨床意義上的健康狀態下豬只并不一定排毒,也就是說豬只在器官組織里存在病毒感染,而血清或唾液里是幾乎檢測不到病毒,這種情況在妊娠母豬上同樣存在,陽性母豬在健康狀態下通過胎盤將病原傳遞給胎兒的機會是較小的。而某個疾病出現臨床表現前后在豬只的胎兒臍帶血、分泌物、血清和唾液中可以檢測到病毒。簡言之,如果在豬只的胎兒臍帶血、分泌物、血清和唾液中可以輕易檢測到病毒,那就說明這個豬只出現了問題。因此在臨床上我們通過這些特殊病料的檢測來判斷豬只是否處于發病或即將發病的狀態,因此實驗室的病原檢測在豬場的疾病監控(發現有病毒血癥的豬只)、疾病診斷等方面具有重要的意義。

再如豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎等,這類疾病的感染潛伏期和排毒期相對較短,在健康豬群的糞便中幾乎檢測不到病毒,而在發病前后這段時間則可以在糞便中檢測病原。因此在臨床上檢測到病毒,表明豬場存在發病的風險或者已經發病,對生產具有很大的指導意義。疾病雖然復雜,但依據不同病料的檢測可以鑒別是什么病原導致的感染風險或發病,結合臨床可以做到準確診斷。

因此我們說把實驗室檢測作為“救火員”其實是一個錯誤的認知,哪怕找到了始作俑者,但你的損失已無法挽回,實驗室檢測在豬場防控中的重要意義在于其預警作用。結合豬場實際情況,特別是養殖規模、模式和環境等因素來制定科學合理的檢測方案,定期做好病原學檢測和血清學監測,合理調整免疫程序,同時加強營養,優化環境,以及有針對性的使用動保產品進行保健,是防控疫病的關鍵。



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